УДК 581.1

 

ГЕННАЯ СЕТЬ И БАЗА ДАННЫХ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К ПАТОГЕННЫМ ГРИБАМ

© 2018 г. О. Г. Смирнова1, В. К. Шумный, А. В. Кочетов

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН”, Новосибирск

Поступил в редакцию 05.04.2017 г.

 

В статье представлено описание генной сети, контролирующей формирование ответа растений на заболевания, вызванные патогенными грибами (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet//viewer/Plant%20fungus%20pathogen.html). В генной сети описаны скоординированные взаимодействия генов, белков и регуляторных молекул, включающие интегрированные защитные механизмы, позволяющие предотвратить развитие инфекции, локализовать очаг поражения и минимизировать ущерб. Генная сеть реконструирована на основе литературных данных, и объекты генной сети связаны с учетными записями базы данных PGR (Pathogenesis-Related Genes, http://srs6.bionet.nsc.ru/srs6bin/cgi-bin/wgetz?-page+top+-newId), в которой накапливается информация о генах устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Реконструкция генной сети позволяет формализовать, визуализировать и систематизировать возможные механизмы ответа растительной клетки на грибную инфекцию, что может быть полезно для планирования экспериментов и интерпретации экспериментальных данных в этой области науки.

 

Ключевые слова: пшеница Triticum aestivum патогенные грибы – иммунитет – гены устойчивости – генная сеть – база данных

 

________________________

Сокращения: АФК − активные формы кислорода; ПКС − программируемая клеточная смерть; BgtBlumeria graminis f. sp. tritici; CC − суперспирализованный (от coiled-coil); PR – связанный с патогенезом (от pathogenesis-related); Pst Puccinia striiformis f. sp. tritici; R − устойчивость (от resistance); RLP − рецептор-подобный белок (от receptor-like protein); QR − количественная устойчивость (от quantitative resistance); NB-LRR − нуклеотид-связывающий, обогащенный лейцином повтор (от nucleotide-binding leucine-rich repeat); RLK − рецептор-подобная киназа (от receptor-like kinase).

1Адрес для корреспонденции: Смирнова Ольга Григорьевна. 630090 Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10. Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ СО РАН). Электронная почта: planta@bionet.nsc.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Растения подвергаются постоянному воздействию огромного количества патогенных грибов, некоторые из которых способны преодолевать защитные барьеры и вызывать различные заболевания. Болезни, вызванные патогенными грибами, приводят к значительным потерям урожая у пшеницы (Triticum aestivum). Некротрофы, такие как Stagonospora nodorum и Pyrenophora tritici-repentis. питаются мертвыми тканями и вызывают от 20 до 70% снижения урожайности у пшеницы [1]. Биотрофы, вызывающие бурую/листовую ржавчину (Puccinia triticina), желтую/полосатую ржавчину (Puccinia striiformis f. sp. tritici; Pst), стеблевую ржавчину (Puccinia graminis f. sp. tritici) и мучнистую росу (Blumeria graminis f. sp. tritici; Bgt) паразитируют на живых тканях, что тоже приводит к значительным потерям урожайности. Механизмы защиты против ржавчин, пятнистостей, мучнистой росы остаются малоизученными. Известно, что заражение патогеном вызывает изменение паттернов транскрипции многих генов, участвующих в формировании защитного ответа. Защищаясь от атаки патогенов, растения развили многоуровневые механизмы защиты. Устойчивость растений к патогенам основывается на сложной сети конститутивных и индуцированных защитных систем, в формировании которых принимают участие продукты большого числа генов [2].

Существуют две различные группы генов, обеспечивающие устойчивость к биотрофным патогенам. Это классические R (Resistance) гены, которые обеспечивают полную, но расо-специфическую, устойчивость на стадии проростков, и QR (Quantitative Resistance) гены, дающие частичную устойчивость. Продукты R генов специфически узнают соответствующие авирулентные эффекторы патогенов, что приводит к включению защитных реакций, в том числе и реакции сверхчувствительности – быстрой гибели клеток в месте проникновения патогена [3]. В отличие от R генов, QR гены не уничтожают инфекцию, а замедляют развитие заболевания и обеспечивают неспецифическую устойчивость к широкому спектру патогенов. Количественный эффект QR генов и тот факт, что они действуют преимущественно на взрослой стадии развития растений, осложняет работу с ними. В результате, наибольшее число исследований касается R генов. Однако, сорта, полученные исключительно с применением эффективных аллелей R генов, являются высоко восприимчивыми к появлению высоковирулентных патотипов. Высокий уровень устойчивости на длительный период может обеспечить совместное использование QR и R генов [4].

Во время инокуляции фитопатогена у растения изменяется экспрессия огромного числа генов. На начальных этапах заражения грибом Zymoseptoria tritici и до появления первых признаков заболевания септориозом наблюдается изменение экспрессии более 3000 генов пшеницы T. aestivum [5]. Эти изменения затрагивают синтез защитных белков, сигнальных молекул, гормонов, лигнина и др. Инфицирование тканей биотрофными грибами Pst и Bgt приводит к изменению транскрипции 23.8% генов T. aestivum. Сравнение изменений в составе транскриптомов показало наличие как общих, так и специфических путей защиты [6]. Сравнительный анализ транскриптомов, регулируемых генами расо-специфической (Yr1, Yr5) и расо-неспецифической (Yr39) устойчивости пшеницы к Pst, показал, что общие транскрипты в значительной степени ограничены классическими PR (Pathgenesis-Related) генами и генами защитного ответа [7]. Изменения транскриптома у изогенных линий пшеницы, различающихся по гену Pm30, контролирующему устойчивость к мучнистой росе, показало, что устойчивость является результатом сложного системного ответа, в который вовлечено большое число путей, в том числе усиление клеточной стенки, биосинтез флавоноидов и метаболические процессы [8]. Количественный протеомный анализ показал, что при взаимодействии пшеницы и Bgt изменения затрагивают PR-белки, белки окислительного стресса, биосинтеза фенилпропаноидов, метаболизма фенилаланина и белки фотосинтетической антенны [9]. Устойчивость к листовой ржавчине, обусловленная геном Lr48, связана не только с восприятием и распознаванием рецепторами эффектора патогена и индукцией специфического защитного ответа, но и с координацией основных клеточных процессов – выработкой энергии, метаболизмом, транспортом, передачей сигнала, протеолизом, регуляцией транскрипции и трансляции [10]. Сорт пшеницы Xingzi 9104 характеризуется расо-неспецифической долговременной устойчивостью взрослых растений к Pst. Секвенирование транскриптома этого сорта на ранних стадиях заражения показало изменение экспрессии 2666 генов. В формировании устойчивости были задействованы процессы, контролирующие механизмы лигнификации, уровня активных форм кислорода (АФК) и сахаров [11].

Помимо белков важную роль в защитном ответе играют и другие классы молекул – например, микроРНК. Идентифицировано и функционально охарактеризовано 1056 микроРНК, участвующих в защитном ответе при взаимодействии пшеницы и P. triticina. Анализ деградома позволил выделить более 700 целевых генов, связанных с защитным ответом, трансдукцией сигнала, развитием, метаболизмом и регуляцией транскрипции [12]. Анализ больших массивов разнородных данных, полученных при взаимодействии пшеницы и патогена, создает успешную платформу для последующих молекулярных и функциональных исследований отдельных генов [6, 9], разработки молекулярных маркеров и их включения в селекционный процесс с применением подходов биоинженерии и геномного редактирования.

Идентифицировано несколько десятков генов пшеницы, обеспечивающих устойчивость к заболеваниям, но только некоторые из этих генов секвенированы. Функции некоторых генов устойчивости изучены, для других выдвинуты предположения о возможных функциях на основе предсказания аминокислотных последовательностей и функциональных доменов кодируемых ими белков. Знание нуклеотидных последовательностей генов защитного ответа существенно расширяет возможности изучения функций этих генов и их регуляцию. Используя методы биоинформатики, можно идентифицировать предполагаемые регуляторные последовательности в промоторах генов с измененным уровнем экспрессии после патогенной атаки. И наоборот, наличие определенных cis-элементов в промоторе генов позволяет предположить наличие у них определенного паттерна экспрессии. Например, анализ экспрессии генов in silico показал, что гены, имеющие в своем промоторе чувствительную к элиситору последовательность CGACTTTT (WT-бокс), с большой долей вероятности индуцируются Botrytis cinerea [13].

Не всегда участие гена в ответной реакции сопровождается изменением его экспрессии. Ответная реакция может сопровождаться изменением функционального состояния белка за счет его модификаций или изменением компартментализации белка. Генная сеть позволяет визуализировать и систематизировать накопленные данные, выделить процессы и молекулы, которые влияют на устойчивость. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе устойчивости к патогенам, мы создали базу данных секвенированных генов устойчивости пшеницы и реконструировали генную сеть с участием этих генов.

 

РЕКОНСТРУКЦИЯ ГЕННОЙ СЕТИ ОТВЕТА НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ

Генная сеть - это группа координированно функционирующих генов, взаимодействующих друг с другом через свои первичные продукты (РНК и белки) и разнообразные метаболиты. Стремительный рост объемов экспериментальных данных и, как следствие, аккумулирующих их баз данных и научных публикаций, явился предпосылкой для создания методов реконструкции генных сетей на основе автоматического анализа текстов научных публикаций и баз данных. Однако, ручная реконструкция генных сетей экспертами с использованием специальных программных средств - редакторов генных сетей - является максимально точной и подробной по сравнению с методами автоматической интеграции [14].

Генная сеть формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами у пшениц, построена с использованием технологии GenNet, ручного курирования и использования литературных данных. Реконструированная генная сеть в формате HTML-страницы представлена по адресу (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet//viewer/Plant%20fungus%20pathogen.html). Технология GenNet позволяет визуализировать гены, РНК, белки, химические вещества, процессы и устанавливать взаимодействия между ними в виде реакций и регуляторных процессов [15]. Компоненты генной сети изображаются различными символами. Прямоугольник используется для обозначения генов, круг – белков, квадрат - низкомолекулярных соединений. Реконструированная нами генная сеть содержит 24 гена, последовательности которых секвенированы, 23 белка и 4 метаболита: салициловую кислоту, АФК, глюкозу и глицерол-3-фосфат (рис. 1а).

Схематическое представление генной сети формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами у пшениц представлено на рисунке 1б. Продуцируемые патогенами молекулы эффекторов являются главными индукторами генной сети формирования ответа на патогенную инфекцию. Они распознаются белками-рецепторами при непосредственном взаимодействии. Включение рецепторов, кодируемых генами устойчивости, способствует передаче сигнала и формированию защитного ответа. Действие патогена вызывает повышение уровня глицерол-3-фосфата и накопление салициловой кислоты. Салициловая кислота повышает экспрессию ряда генов, в том числе Rlp1.1, кодирующего рецептор-подобный белок. RLP1.1 влияет на защитный ответ, повышая экспрессию Pr генов. Гены Lr34 и Lr67 обеспечивают устойчивость пшеницы ко многим патогенам, влияя на транспорт различных молекул. Примером одного из негативных регуляторов защитного ответа может служить транскрипционный фактор NAC21/22, экспрессия которого регулируется микроРНК miR164.

 

ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К ПАТОГЕНАМ

Гены устойчивости (R гены) кодируют нуклеотид-связывающие белки, обогащенные лейцином (NB-LRR, nucleotide-binding leucine-rich repeat), которые часто содержат суперспирализованный (CC) домен. В функциональном плане NB-LRR белки являются рецептор-подобными киназами (RLK, receptor-like kinases), принадлежащими к семейству серин-треонин киназ, и рецептор-подобными белками (RLP, receptor-like proteins). Эти рецепторы способны распознавать соответствующие белковые эффекторы патогенов. Предсказано, что Pst может синтезировать более 1000 разнообразных эффекторов [16]. Знание консервативных доменов и использование методов биоинформатики позволило идентифицировать несколько сотен аналогов генов устойчивости (RGA, Resistance Gene Analog) в секвенированных участках генома пшеницы [17]. Для некоторых R генов было доказано участие в защитном ответе.

Ген Lr10 кодирует белок, N-конец которого, в противоположность другим описанным CC-NBS-LRR рецепторам, подвержен интенсивной селекции. При экспрессии в трансгенных растениях Lr10 обеспечивает повышенную устойчивость пшеницы к листовой ржавчине. Ген Lr10 не имеет тесного родства с другими Lr-генами пшеницы, хотя имеет сходство с генами устойчивости у риса и ячменя. Было показано, что для функционирования гена Lr10 необходимо присутствие гена Rga2, тесно сцепленного с Lr10. Rga2 имеет лишь отдаленное родство с Lr10, что исключает обмен последовательностями между паралогами [18]. У устойчивого сорта ThatcherLr10 экспрессия генов Lr10 и Rga2 не индуцируется P. triticina [19]. Возможно белки LR10 и RGA2 необходимы для узнавания патогенного эффектора в составе мультимерного белкового комплекса, в котором они непосредственно между собой не контактируют. С другой стороны, высокий консерватизм белка RGA2 позволяет предположить, что этот белок может функционировать в сигнальном пути индукции устойчивости к патогенам на более поздних этапах, в то время как LR10 может участвовать в распознавании эффекторов. Таким образом, устойчивость, связанная с Lr10 локусом, зависит от двух тесно сцепленных CC-NBS-LRR белков. Эти белки могут представлять собой важные элементы сложного молекулярного механизма обнаружения патогенов у пшениц и последующей трансдукции сигнала [19] (рис. 2).

Ген Lr1 кодирует белок CC-NBS-LRR типа, который эффективно борется с листовой ржавчиной у пшеницы [20]. Было проведено изучение экспрессии нескольких тысяч генов у Lr1-трансгенных растений, зараженных авирулентной расой P. triticina. Было показало, что Lr1 включает сигнальные каскады, приводящие к активации генов, модулирующих метаболические процессы и защитный ответ. У Lr1-трансгенных растений повышается уровень экспрессии транскрипционного фактора WRKY40, который непосредственно участвует в активации защитных генов, а также WRKY70, что предполагает активацию сигнального пути салициловой кислоты [21].

Заражение линий трансгенной пшеницы HD2329+Lr28 авирулентной расой P. triticina показало, что ген устойчивости Lr28 влияет на индукцию экспрессии гена Lr1 и на повышение экспрессии четырех других Lrr-Rlk генов [2] (рис. 2).

Показано, что киназный домен TaRLK-R3 способен к автофосфорилированию. Автофосфорилирование остатков серина и треонина наблюдается при активации рецептора. Гомеологичные Rlk-R гены расположены на хромосомах 1A, 1B и 1D пшеницы. При заражении Pst повышение транскрипции Rlk-R генов усиливает реакцию сверхчувствительности [22].

Экспрессия генов Rlk, Rlk1 и Rlk2 возрастает при действии Bgt. Изучение растений со сверхэкспрессией и пониженной экспрессией генов Rlk1 и Rlk2 доказало их участие в защитном ответе при заражении пшеницы Bgt. Повышение экспрессии генов Rlk1 и Rlk2 при действии салициловой кислоты и перекиси водорода предполагает участие этих регуляторных молекул в ответной реакции на Bgt [23] (рис. 2). Ген Rlk экспрессируется только в зеленых частях растений пшеницы [24]. Rlk является гомологом гена Lrk10, который тесно сцеплен с геном Lr10, контролирующим устойчивость пшеницы к листовой ржавчине [25]. Rlk, Rlk1 и Rlk2 являются источником новых генов устойчивости пшеницы к Bgt. Гены Rlk1 и Rlk2 расположены на длинном плече хромосомы 2B пшеницы.

RLP1.1 влияет на формирование защитного ответа, повышая экспрессию Pr1, Pr2, Pr5 генов пшеницы и усиливая реакцию сверхчувствительности в зоне инфицирования. Активность гена Rlp1.1 пшеницы включается продуктом гена Yr26 в присутствии патогена Pst и повышается при действии салициловой кислоты и перекиси водорода [26] (рис. 2).

RAR1/SGT1/HSP90 комплекс выполняет важную роль в защитном ответе, обеспечивая правильную структуру и стабильность многих NBS-LRR белков [27, 28]. Белки RAR1, SGT1 и HSP90 необходимы для реализации устойчивости к листовой ржавчине, опосредованной геном Lr21 [29, 30] (рис. 2). Показано, что при заболевании ячменя мучнистой росой эффекторный белок CSEP0105, секретируемый патогеном Bgt, взаимодействует с белком теплового шока Hsp16.9 ячменя. CSEP0105 интерферирует с шаперонной активностью Hsp16.9, направленной на поддержание структуры белков защитного ответа ячменя, и усиливает вирулентность патогена [31].

 

ДОЛГОВРЕМЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

У пшениц идентифицировано небольшое число генов, которые обеспечивают долговременную устойчивость взрослых растений одновременно ко многим расам возбудителей таких заболеваний, как листовая ржавчина (Lr, leaf rust), желтая ржавчина (Yr, yellow rust), стеблевая ржавчина (Sr, stem rust) и мучнистая роса (Pm, powdery mildew). Это такие гены как Lr34/Yr18/Pm38/Ltn1, Lr67/Sr55/Yr46, Lr46/Sr58/Yr29/Pm39/Ltn2 и Lr27/Sr2/Yr30/Pbc1 [32, 33, 34, 35]. Биохимические и физиологические механизмы устойчивости сразу ко многим патогенам представляют особый интерес. Молекулярный анализ структурно-функциональной организации этих генов может способствовать пониманию базовых механизмов устойчивости. Множественная устойчивость обеспечивается функциональной спецификой продуктов этих генов. Гены Lr34 и Lr67 секвенированы.

Ген Lr34 уже на протяжении более 100 лет обеспечивает определенный уровень устойчивости проростков пшеницы, растущих при пониженных температурах, а также взрослых растений, к листовой ржавчине, желтой ржавчине и мучнистой росе. Ген кодирует АТФ-связывающий кассетный транспортер ABC (ATP-binding cassette) подсемейства ABCG [36]. Белки ABCG обеспечивают транспорт через биологические мембраны структурно неродственных метаболитов, включая вирулентные компоненты патогенного происхождения, и, таким образом, могут участвовать в формировании устойчивости к патогенам [37]. У устойчивых образцов Lr34-трансгенных и изогенных растений пшеницы не наблюдается повышение экспрессии Pr1,2,3 генов, накопление АФК, реакции сверхчувствительности и укрепление клеточной стенки. Устойчивость проявляется в снижении роста гиф, уменьшении размера колоний и числа сайтов инфицирования, повышении латентного периода [4, 38]. У устойчивых растений наблюдается некроз кончиков флаговых листьев. Возможно, при ответной реакции на действие патогена с участием гена Lr34 используются те же механизмы, которые задействованы при старении тканей растений [36]. Гексаплоидные пшеницы содержат 3 копии гена Lr34 в хромосомах 7A, 7D и 4A, последняя несет транслокацию из хромосомы 7B. Устойчивые аллели Lr34 расположены на хромосоме 7D. Экспрессия гена Lr34 повышается в процессе онтогенеза и не зависит от присутствия патогена [4, 37].

 

МЕТАБОЛИЗМ САХАРОВ

Метаболизм сахарозы играет важную роль в регуляции устойчивости к стрессам. Сахара необходимы не только как субстраты для жизнедеятельности, но и являются важными сигнальными молекулами во время формирования защитного ответа [39].

Ген Lr67 обеспечивает долговременную устойчивость к листовой, стеблевой и желтой ржавчинам. Белок LR67 переносит сахара через плазматическую мембрану и относится к STP13 классу транспортеров гексоз. Белок LR67 чувствительных генотипов пшеницы является высоко-аффинным транспортером глюкозы, в то время как белок устойчивых генотипов не способен транспортировать глюкозу [40]. Белок функционирует в виде как гомо-, так и гетеродимеров, в формировании которых принимают участие продукты гомеологичных генов пшеницы. У устойчивых линий пшеницы присутствует хотя бы одна субъединица LR67res, что приводит к формированию доминантной негативной формы белка-транспортера, к пониженному уровню транспорта глюкозы и повышенной устойчивости. Промоторы как устойчивых и чувствительных аллелей гена Lr67 имеют одинаковые последовательности и одинаково индуцируются после заражения ржавчиной. Экспрессия генов TaStp-4A и TaStp-4B, гомеологичных Lr67 и расположенных на хромосомах 4A и 4B, также возрастает после действия патогена [40].

Патогены индуцируют экспрессию SWEET генов, кодирующих транспортеры сахаров. Повышение экспорта сахаров усиливает питание патогенов. У некоторых видов растений изучены механизмы активации транспорта глюкозы патогенами. Показано, что эффектор бактериального патогена PthXo1 является транскрипционным активатором, который непосредственно взаимодействуют с промотором гена транспортера глюкозы риса SWEET11 [41]. В индукции гена SWEET4 винограда участвуют АФК и вирулентные факторы Botrytis cinerea [42]. Блокирование функции SWEET генов приводит к торможению роста и вирулентности патогенов [43].

Щелочная/нейтральная инвертаза A/N-INV1 расщепляет сахарозу в цитозоле пшеницы. Идентифицировано три копии гена TaA/N-Inv1, расположенные на хромосомах 4A, 4B и 4D. Уровень транскриптов TaA/N-Inv1 повышается после действия Pst и абиотических стрессов. TaA/N-INV1 является негативным регулятором устойчивости пшеницы к Pst, повышая накопление гексоз в цитоплазме, снижая фотосинтез и блокируя продукцию АФК [44].

 

РЕГУЛЯТОРНЫЕ МОЛЕКУЛЫ

Распространение сигнала о патогенной атаке по тканям растения имеет большое значение при запуске защитных механизмов. Глицерол-3-фосфат является одним из регуляторов защитного ответа. Глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа и глицеролкиназа являются ключевыми ферментами, участвующими в биосинтезе глицерол-3-фосфата у пшеницы. Экспрессия генов Gly1 и Gli1, кодирующих эти ферменты, существенно повышается при действии авирулентной расы Pst, что приводит к повышению уровня глицерол-3-фосфата и накоплению салициловой кислоты [45].

Считается, что развитие системной приобретенной устойчивости при детекции растением биотрофного патогена происходит с участием салициловой кислоты и ее производных. Салициловая кислота является важным регулятором, повышая реакцию сверхчувствительности, системный ответ, экспрессию Pr (Pathogenesis-related) генов [46, 47] и ряда других генов, в том числе Adf7, Cab1, Myb4, Rlp1.1 [26, 48,49, 50].

АФК, такие как перекись водорода и кислородные радикалы, являются неотъемлемыми компонентами сигнальных путей стрессового ответа, регулируя программируемую клеточную смерть (ПКС) [51]. АФК образуются в различных компартментах клеток растений в ответ на инфекцию. Низкие концентрации АФК действуют как сигнальные молекулы, активируя PR белки и системную приобретенную устойчивость. Высокие концентрации АФК вызывают клеточную смерть [52].

Важную роль в путях передачи сигналов при биотическом и абиотическом стрессе играют ионы кальция. У пшеницы идентифицирован связывающий кальций трансмембранный белок CAB1 (calcium binding EF-hand protein 1). При совместимом взаимодействии пшеницы и Pst, в процессе которого у растений формируется устойчивость к заболеванию, уровень экспрессии Cab1 возрастает сильнее, чем при несовместимом взаимодействии, приводящем к заболеванию. Транскрипция Cab1 повышается при действии салициловой кислоты, абсцизовой кислоты, жасмоната, этилена, цитокинина, а также при действии осмотического стресса, холода, засолении и поранении. CAB1 участвует в распознавании растением патогена, развитии симптомов заболевания и формировании базовой устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам через сигнальный путь салициловой кислоты [48].

 

PR-БЕЛКИ

Индукция Pr генов у пшеницы в ответ на инфекцию патогенными грибами описывается часто, однако, биохимические функции этих белков изучены недостаточно. Белки семейства PR-1 являются маркерами реакции сверхчувствительности и системной приобретенной устойчивости, опосредованной действием салициловой кислоты, и наиболее известны из многочисленных семейств PR белков [4].

Некротрофные грибы Stagonospora nodorum и Pyrenophora tritici-repentis синтезируют токсин ToxA, который взаимодействует с белками хлоропластов, что приводит к развитию септориозной и желтой пятнистостей пшеницы. Показано, что непосредственное взаимодействие димерного белка пшеницы PR-1-5 с токсином ToxA способствует развитию некроза. Более того, в ответ на действие токсина экспрессия гена Pr-1-5 существенно возрастает у чувствительного сорта пшеницы. Таким образом, ToxA влияет на механизмы защитного ответа у чувствительных пшениц, что способствует развитию заболевания [53].

Эффектор CSEP0055 биотрофного гриба Blumeria graminis f. sp. hordei взаимодействует с белками ячменя PR1a, PR1b и PR17c [54]. Во время патогенной атаки в эпидермисе наблюдается повышение экспрессии генов Pr1a, Pr1b, Pr17c. мРНК Pr17c обнаруживается в значительном количестве в папиллах эпидермальных клеток, которые служат для укрепления клеточной стенки в местах проникновения патогена [55]. Белок PR17c очень важен для формирования устойчивости к проникновению патогена [54]. Таким образом, PR-белки могут быть потенциальными мишенями для эффекторов некротрофных и биотрофных грибов.

В формировании устойчивости взрослых растений пшеницы к Pst принимают участие белки PR10 и PR5 [56, 57]. Транскрипция Pr5 поддерживается на низком уровне при совместимом взаимодействии и существенно повышается при несовместимом взаимодействии пшеницы и Pst. Салициловая, жасмоновая, абсцизовая кислоты и стрессы (холод, засоление, поранение) также индуцируют экспрессию Pr5. При несовместимом взаимодействии белок PR5 накапливается в клеточных стенках листьев пшеницы. Белок PR5 предположительно проявляет бета-1,3-эндоглюконазную активность по отношению к полисахаридам, содержащимся в клеточной стенке гриба, что приводит к повышению проницаемости плазматической мембраны патогена. Тауматин-подобный белок пшеницы PR5 кодируется одним геном [57].

 

ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ

Транскрипционные факторы регулируют работу генов устойчивости. Транскрипционный фактор MYB4 является позитивным регулятором устойчивости пшеницы к Pst. Уровень MYB4 существенно повышается при инфекции и действии салициловой кислоты [49]. Транскрипционный фактор NAC4 также является позитивным регулятором формирования устойчивости к Pst. Транскрипция гена Nac4 в листьях пшеницы индуцируется после действия Pst, метил-жасмоната, этилена и абсцизовой кислоты. Салициловая кислота и внешние условия, такие как засоление, поранение и холод, не оказывают видимого эффекта на экспрессию Nac4. Результаты свидетельствуют о том, что NAC4 функционирует как транскрипционный активатор при реакции пшеницы не только на биотический, но и на абиотический стресс [58].

В противоположность MYB4 и NAC4, транскрипционный фактор NAC21/22 является негативным регулятором защитного ответа. Уровень мРНК NAC21/22 снижается при участии микроРНК miR164 [59]. При несовместимом взаимодействии пшеницы с Pst высокий уровень экспрессии miR164 обеспечивает конститутивно низкий уровень мРНК NAC21/22 за счет ее деградации. Наоборот, в процессе совместимого взаимодействия растений пшеницы с Pst уровень miR164 в течение первого дня инфицирования снижается. В результате ко второму дню после инфекции уровень мРНК NAC21/22 повышается в 11 раз. Повышение уровня негативного регулятора транскрипции NAC21/22 приводит к блокировке транскрипции генов защитного ответа [59].

Сигнальный путь MED25-EIL1-ERF1 является негативным регулятором устойчивости пшеницы к мучнистой росе [60]. Активация транскрипционного фактора EIL1 (ethylene insensitive3-like1) происходит после его непосредственного взаимодействия с MED25 (mediator subunit 25). MED25 и EIL1 синергически активируют транскрипцию гена ERF1 (ethylene response factor1), что приводит к снижению устойчивости к Bgt за счет репрессии транскрипции Pr генов и снижения накопления АФК. Идентифицированы три гомоаллеля MED25, расположенные на 5A, 5B и 5D хромосомах пшеницы [60].

К сожалению, молекулярные механизмы регуляции активности генов у пшеницы изучены недостаточно. В настоящее время уже идентифицировано большое количество генов, экспрессия которых меняется во время инфицирования. Необходимы дальнейшие исследования для установления генов-мишеней транскрипционных факторов, участвующих в защитном ответе.

 

РЕАКЦИЯ СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

Взаимодействие внутриклеточных рецепторов растений и эффекторов патогенов индуцирует запуск реакции сверхчувствительности, которая является одной из форм ПКС и характеризуется быстрой гибелью клеток вокруг сайта инфицирования патогеном [3].

Реакция сверхчувствительности наблюдается на начальных стадиях как при совместимом, так и Yr1-зависимом несовместимом взаимодействии пшеницы и Pst. При совместимом взаимодействии реакция сверхчувствительности начинается позже, протекает менее интенсивно и на поздних стадиях заражения пшеницы практически подавлена по сравнению с несовместимым взаимодействием. Первичная ПКС наблюдается в клетках мезофилла, непосредственно контактирующих с гифами. Вторичная ПКС наблюдается в прилегающих клетках, что свидетельствует об активации межклеточных сигналов [7].

При заражении Pst возрастает уровень экспрессии гена Dad2 (defender against cell death 2). DAD2 влияет на экспрессию генов защитного ответа Pr1, Pr2, Pr5 и генов, кодирующих каталазу и пероксидазу, которые участвуют в поддержании уровня АФК (рис. 3). DAD2 может функционировать как супрессор ПКС на ранних стадиях взаимодействия пшеницы и Pst и выполнять противоположную роль при развитии реакции сверхчувствительности на более поздних этапах заражения [61].

Белок TYPA (tyrosine phosphorylation protein A) принадлежит к семейству рибосом-связанных ГТФаз и расположен в хлоропластах. У многих бактерий подобный белок функционирует как глобальный регулятор устойчивости. Уровень транскриптов TypA повышается при действии АФК, холода и авирулентной расы Pst. Действие вирулентной расы не влияет на экспрессию гена. Супрессия TypA снижает устойчивость пшеницы к Pst, что сопровождается повышением экспрессии каталазы и супероксиддисмутазы, снижением уровня АФК и реакции сверхчувствительности, усилением роста и ветвления гиф. Три копии гена TypA расположены на хромосомах 6A, 6B и 6D пшеницы [62].

Хлоропластный белок монодегидроаскорбатредуктаза MDAR6 (monodehydroascorbate reductase) снижает уровень окисленного аскорбата. При совместимом взаимодействии пшеницы и Pst уровень транскриптов MDAR6 возрастает сильнее, чем при несовместимом взаимодействии. Супрессия MDAR6 увеличивает продукцию перекиси водорода, ПКС и устойчивость к Pst. Таким образом, MDAR6 является негативным регулятором устойчивости пшеницы к Pst, снижая уровень перекиси водорода и ПКС [52] (рис. 3).

Цитоплазматическая монодегидроаскорбатредуктаза MDHAR (monodehydroascorbate reductase) играет важную роль в поддержании уровня АФК. При инфекции Pst происходит снижение уровня Mdhar при участии микроРНК PN-2013. Это приводит к повышению уровня перекиси водорода и экспрессии генов Pr1, Pr2, Pr3 и Pr5, для которых АФК являются важным регуляторным сигналом (рис. 3). Таким образом, супрессия MDHAR во время инфекции Pst увеличивает устойчивость пшеницы к патогену [63, 64] (рис. 3).

Метакаспаза MCA4 является цистеин-зависимой протеазой, которая усиливает реакцию сверхчувствительности у пшеницы. Экспрессия гена Mca4 возрастает при действии авирулентной расы Pst и практически не меняется при взаимодействии пшеницы с вирулентной расой. Подавление экспрессии гена Mca4 приводит к снижению устойчивости к Pst и уменьшению зоны некроза в сайте инфицирования [65]. Недавно был идентифицирован ген Mca1, экспрессия которого возрастает в 5 раз через 72 часа после инокуляции авирулентной расой Pst и в 40 раз через 48 часов после инокуляции вирулентной расой. Подавление экспрессии гена Mca1 приводит к повышению устойчивости к Pst и накоплению перекиси водорода. MCA1 является негативным регулятором ПКС в листьях табака и пшеницы, индуцированной геном Bax мыши [66]. Таким образом, у пшеницы идентифицированы две метакаспазы, MCA4 и MCA1, разнонаправленно регулирующие реакцию сверхчувствительности в ответ на действие Pst. MCA4 усиливает, в то время как MCA1 ингибирует ПКС в листьях пшеницы [65, 66] (рис. 3). Подобный механизм “уравновешивания” или ограничения развития ответной реакции является консервативным. У арабидопсиса метакаспазы MC1 и MC2 также разнонаправленно контролируют реакцию сверхчувствительности, активированную внутриклеточными иммунными рецепторами [67].

LSD1 (lesion simulating disease 1) является негативным регулятором реакции сверхчувствительности. Динамика повышения экспрессии Lsd1 отличается при несовместимом и совместимом взаимодействии пшеницы и Pst. Окислительный стресс вызывает существенное повышение экспрессии Lsd1. Супрессия Lsd1 приводит к повышению устойчивости и сопровождается повышением экспрессии гена Pr1, реакции сверхчувствительности и снижением роста гиф гриба [68].

Ген WKS1/Yr36 (wheat kinase start 1) является одним из немногих генов, обеспечивающих устойчивость пшеницы к широкому спектру рас Pst при повышенных температурах. Этот ген впервые был обнаружен у дикой полбы Triticum turgidum ssp. dicoccoides и локализован в коротком плече хромосомы 6B. Уровень транскрипта WKS1/Yr36 повышается при действии Pst (рис. 3) и высоких температур. Белок WKS1 содержит необычную комбинацию серин/треонин-киназного и START липид-связывающего доменов, оба из которых важны для устойчивости к Pst [69]. В хлоропластах WKS1 фосфорилирует связанную с тилакоидами аскорбат-пероксидазу, снижает ее способность обезвреживать АФК и способствует ПКС. Повышение экспрессии WKS1/Yr36 у трансгенных пшениц ускоряет старение листьев в отсутствии Pst [70].

 

ЦИТОСКЕЛЕТ

Динамика актинового цитоскелета клеток пшеницы важна для защитного ответа. Изменение архитектуры фибрилл актина при действии Pst может приводить к затруднению проникновения гриба [71]. Динамика перестройки актинового цитоскелета регулируется большим числом связывающих актин белков. Факторы, деполимеризующие актин (ADF, actin-depolymerizing factor), модулируют структуру актинового цитоскелета и чувствительны к различным воздействиям. У пшеницы идентифицировано два фактора, ADF7 и ADF3, оказывающих, соответственно, позитивное и негативное влияние на устойчивость.

При действии Pst ADF7 изменяет динамику цитоскелета и влияет на накопление АФК (рис. 3). Транскрипционная активность трех копий гена Adf7, расположенных на хромосомах 1A, 1B и 1D пшеницы, резко повышается в ответ на действие авирулентной расы Pst и салициловой кислоты. При подавлении экспрессии гена Adf7 существенно снижается экспрессия гена Pr1, маркера пути передачи сигнала салициловой кислоты, а также генов Pr2 и Pr5. Также происходит снижение уровня накопления АФК и ослабление реакции сверхчувствительности за счет повышения экспрессии генов супероксиддисмутазы и каталазы, участвующих в утилизации АФК, и понижения экспрессии гена НАД∙H-оксидазы, участвующей в генерации АФК [50].

В противоположность ADF7, ADF3 функционирует как негативный регулятор устойчивости пшеницы к Pst. Подавление экспрессии ADF3 увеличивает устойчивость к Pst и сопровождается повышением экспрессии генов Pr1 и Pr2. Наблюдаемые при этом затруднения проникновения патогена и образования гаусториев, возможно, связаны с изменением распределения нитей актина при действии как авирулентной, так и вирулентной рас Pst. У растений с пониженной экспрессией ADF3 обработка вирулентной расой Pst приводит к повышению уровня АФК и реакции сверхчувствительности. Аналогичные растения, обработанные авирулентной расой Pst, несмотря на повышение устойчивости, имеют пониженный уровень АФК и реакцию сверхчувствительности. В данном случае остаточный уровень ADF3 достаточен для повышения устойчивости, но его не хватает для развития реакции сверхчувствительности. Полученные результаты позволяют говорить о том, что нет прямой связи между реакцией сверхчувствительности и устойчивостью [71]. Экспрессия ADF3 пшеницы индуцируется вирулентной расой Pst и репрессируется авирулентной расой Pst. Три копии гена ADF3 расположены на хромосомах 5AL, 5BL и 5DL [71].

 

ДЛИННЫЕ МЕЖГЕННЫЕ НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК

Инфицирование пшеницы Bgt и Pst вызывает значительные изменения экспрессии генов, кодирующих длинные межгенные некодирующие РНК (дмнРНК), которые содержат более 200 нуклеотидов. При Bgt инфекции изменяется уровень экспрессии 254 дмнРНК, при Pst инфекции - 52 дмнРНК. Предполагается, что дмнРНК с измененным после инфицирования уровнем экспрессии играют важную роль в защите от патогенов у пшеницы, взаимодействуя с микроРНК и регулируя альтернативный сплайсинг [72].

 

БАЗА PRG

Объекты генной сети, представленной в формате HTML-страницы, снабжены активными ссылками на учетные записи генов в созданной нами базе данных PRG (Pathogenesis-Related Genes, http://srs6.bionet.nsc.ru/srs6bin/cgi-bin/wgetz?-page+top+-newId), описывающей секвенированные и функционально изученные гены устойчивости к грибным патогенам [73]. Каждый представленный в генной сети ген (рис. 1) имеет одну или несколько ссылок на учетные записи в базе PRG. Это связано с существованием у пшеницы гомеологичных и родственных генов, выполняющих схожие функции. Кликнув, например, на ген Hsp90 в генной сети, пользователь получит информацию о генах пшеницы HSP90.3-D, HSP90.3-B, HSP90.3-A, HSP90.2-B, HSP90.2-A, HSP90.2-D, представленных в базе PRG. Кликнув на ген Pr, можно получить информацию о генах PR5, PR10, Pr-1-20, Pr-1-3, Pr-1-6, Pr-1-7, Pr-1-16, Pr-1-19, включая описание их функций, уровень экспрессии и нуклеотидные последовательности.

В базе PRG содержится информация о генах, обеспечивающих устойчивость пшеницы и родственных ей злаков к заболеваниям, вызванных патогенными грибами. База данных PRG включает в себя три раздела: таблицу генов PRG_GENE, таблицу аллелей PRG_ALLELE и таблицу последовательностей PRG_SEQUENCE, связанных между собой перекрестными ссылками (рис. 4).

В таблице PRG_GENE приведена информация о названии гена, его хромосомной локализации, продукте гена, его функциях и об изменении экспрессии гена в ответ на действие патогена, гормонов и условий окружающей среды. В таблице PRG_ALLELE приводятся данные о полиморфизмах генов, ассоциированных с различными уровнями устойчивости к заболеваниям. Нуклеотидные последовательности генов представлены в таблице PRG_SEQUENCE.

Интерфейс базы PRG обеспечивает возможность просматривать списки представленных в базе генов и их продуктов; видов, сортов и мутантных линий растений устойчивых и чувствительных к заболеваниям, вызывающих заболевания патогенных организмов, а также ключевых слов. Используя систему поиска, пользователь имеет возможность найти ген по его названию, видовой принадлежности, расположению на хромосоме, чувствительности к патогену и получить нуклеотидную последовательность выбранного гена. Например, чтобы найти гены, расположенные на пятой хромосоме и связанные с устойчивостью пшеницы к Pt, надо в поисковой таблице напротив поля “mapping” ввести цифру 5, а напротив поля “pathogen” ввести название возбудителя заболевания “Puccinia triticina” и выполнить поисковый запрос, нажав на кнопку “Submit Query” (рис. 5).

В результате из базы данных будут выбраны гены, удовлетворяющие запросу (рис. 6). После перехода по выбранной ссылке пользователь получает информацию о гене и его нуклеотидную последовательность. Представленные в базе PRG нуклеотидные последовательности генов могут быть использованы в различных целях, в том числе для создания маркеров при поиске новых генов устойчивости.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Используя технологию GenNet, мы представили регуляторные взаимодействия между генами защитного ответа у пшениц во время инфицирования патогенными грибами. Генная сеть объединяет действия секвенированных генов устойчивости в единый процесс формирования защитного ответа. Экспрессия многих представленных в сети генов индуцируется после атаки патогенов. Изменение динамики экспрессии патоген-чувствительных генов характеризуется выраженным отклонением от нормы через 18-48 часов после действия патогена с последующим возвращением к норме. Такое выраженное отклонение параметров с последующим возвращением к норме характерно для генных сетей стрессового ответа [14]. Некоторые гены, например, Lr10 и Rga2, экспрессируются конститутивно. Экспрессия генов Mdhar и Nac21/22 снижается. К сожалению, в литературе пока нет информации об изменении экспрессии таких важных генов, как Lr34 и Lr21.

Наряду с позитивными регуляторами, в генной сети присутствуют и негативные регуляторы, действие которых направлено на стабилизацию процесса, такие как транскрипционный фактор NAC21/22, LSD1 (негативный влияющий на ПКС), ADF7 и DAD2 (снижающие уровень АФК), MDHAR и LSD1 (негативно влияющие на экспрессию Pr генов).

Регуляторные районы генов эукариот содержат большое количество сайтов связывания транскрипционных факторов, что обеспечивает огромное разнообразие вариантов регуляции экспрессии одного и того же гена. Для генных сетей стрессового ответа характерен кассетный механизм активации транскрипции больших групп генов отдельными транскрипционными факторами. Можно предположить, что такой механизм функционирует и при защитном ответе. В генной сети происходит активация экспрессии транскрипционных факторов MYB4 и NAC4. Идентификация генов-мишеней этих транскрипционных факторов позволит расширить список генов, участвующих в формировании защитного ответа. В настоящее время несмотря на идентификацию большого числа генов, экспрессия которых меняется в ответ на заражение патогенными грибами у пшениц, тонкие механизмы взаимодействия этих генов пока не изучены. Координированная работа генов устойчивости и защитного ответа обеспечивает адекватную реакцию устойчивых генотипов пшеницы на патогенную инфекцию. На основании имеющихся данных пока нет возможности выделить ключевые регуляторы, обеспечивающие координацию экспрессии генов в сети. Сравнение с информацией доступной для более изученных в генетическом плане объектов позволяет предполагать существование у пшениц аналогичных регуляторных путей. Но в любом случае, требуется проведение экспериментальных исследований для доказательства существования таких путей у пшениц.

Рассмотрение структурно-функциональной организации генной сети формирования ответа на патогенную инфекцию позволяет говорить о разнообразии молекулярных механизмов, обеспечивающих ее функционирование за счет изменения интенсивности процессов транскрипции, стабильности РНК, транспорта глюкозы. Важную роль играют такие сигнальные молекулы, как салициловая кислота, активные формы кислорода, глюкоза и глицерол-3-фосфат.

Функциональную роль в защитном ответе большого числа генов, экспрессия которых меняется после заражения пшеницы патогенными грибами, еще предстоит изучить. Значительная часть секвенированных к настоящему моменту генов устойчивости пшеницы проаннотирована в базе PRG и внесена в генную сеть. Информация накапливается с огромной скоростью. База данных PRG и технология реконструкции генных сетей могут служить инструментами для систематизации наших знаний о механизмах защитного ответа у растений. Понимание процессов, происходящих в растениях, помогает не только противостоять атакам уже существующих рас патогенов, но и позволяет использовать потенциал растений для предотвращения заражения растений новыми расами патогенов.

 

Работа поддержана бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН №0324-2016-0001.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Жуковский А.Г., Ильюк А.Г., Буга С.Ф., Склименок Н.А., Кремнева О.Ю., Волкова Г.В., Гудошникова Е.С. Поражаемость сортов озимой пшеницы септориозом (Septoria spp.) и желтой пятнистостью (Pyrenophora tritici-repentis) в условиях республики Беларусь и Северо-Кавказского региона России // Научный журнал КубГАУ. 2012. №. 80. (электронный журнал). URL:http://ej.kubagro.ru/2012/06/pdf/19.pdf (дата обращения: 16.02.2017).

2. Chandra S., Singh D., Pathak J., Kumari S., Kumar M., Poddar R., Balyan H.S., Gupta P.K., Prabhu K.V., Mukhopadhyay K. De novo assembled wheat transcriptomes delineate differentially expressed host genes in response to leaf rust infection // PLoS One. 2016. V. 11: e0148453. doi 10.1371/journal.pone.0148453

3. Шафикова Т.Н., Омеличкина Ю.В. Молекулярно-генетические аспекты иммунитета растений к фитопатогенным бактериям и грибам // Физиология растений. 2015. Т. 62. С. 611−627.

4. Risk J.M., Selter L.L., Krattinger S.G., Viccars L.A., Richardson T.M., Buesing G., Herren G., Lagudah E.S., Keller B. Functional variability of the Lr34 durable resistance gene in transgenic wheat // Plant Biotechnol. J. 2012. V. 10. P. 477−487.

5. Rudd J.J., Kanyuka K., Hassani-Pak K., Derbyshire M., Andongabo A., Devonshire J., Lysenko A., Saqi M., Desai N.M., Powers S.J., Hooper J., Ambroso L., Bharti A., Farmer A., Hammond-Kosack K.E., Dietrich R.A., Courbot M. Transcriptome and metabolite profiling of the infection cycle of Zymoseptoria tritici on wheat reveals a biphasic interaction with plant immunity involving differential pathogen chromosomal contributions and a variation on the hemibiotrophic lifestyle definition // Plant Physiol. 2015. V. 167. P. 1158−1185.

6. Zhang H., Yang Y., Wang C., Liu M., Li H., Fu Y., Wang Y., Nie Y., Liu X., Ji W. Large-scale transcriptome comparison reveals distinct gene activations in wheat responding to stripe rust and powdery mildew // BMC Genomics. 2014. V. 15: 898. doi 10.1186/1471-2164-15-898

7. Bozkurt T.O., McGrann G.R., MacCormack R., Boyd L.A., Akkaya M.S. Cellular and transcriptional responses of wheat during compatible and incompatible race-specific interactions with Puccinia striiformis f. sp. tritici // Mol. Plant Pathol. 2010. V. 11. P. 625−640.

8. Xin M., Wang X., Peng H., Yao Y., Xie C., Han Y., Ni Z., Sun Q. Transcriptome comparison of susceptible and resistant wheat in response to powdery mildew infection // Genomics Proteomics Bioinformatics. 2012. V. 10. P. 94−106.

9. Fu Y., Zhang H., Mandal S.N., Wang C., Chen C., Ji W. Quantitative proteomics reveals the central changes of wheat in response to powdery mildew // J. Proteomics. 2016. V. 130. P. 108−119.

10. Dhariwal R., Gahlaut V., Govindraj B.R., Singh D., Mathur S., Vyas S., Bandopadhyay R., Khurana J.P., Tyagi A.K., Prabhu K.V., Mukhopadhyay K., Balyan H.S., Gupta P.K. Stage-specific reprogramming of gene expression characterizes Lr48-mediated adult plant leaf rust resistance in wheat // Funct. Integr. Genomics. 2015. V. 15. P. 233−245.

11. Hao Y., Wang T., Wang K., Wang X., Fu Y., Huang L., Kang Z. Transcriptome analysis provides insights into the mechanisms underlying wheat plant resistance to stripe rust at the adult plant stage // PLoS One. 2016. V. 11: e0150717. doi 10.1371/journal.pone.0150717

12. Kumar D., Dutta S., Singh D., Prabhu K.V., Kumar M., Mukhopadhyay K. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (Triticum aestivum L.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis // Planta. 2017. V. 245. P. 161−182.

13. Bolívar J.C., Machens F., Brill Y., Romanov A., Bülow L., Hehl R. 'In silico expression analysis', a novel PathoPlant web tool to identify abiotic and biotic stress conditions associated with specific cis-regulatory sequences // Database (Oxford). 2014. V. 2014: bau030. doi 10.1093/database/bau030

14. Колчанов Н.А., Игнатьева Е.В., Подколодная О.А., В.А. Лихошвай В.А., Ю.Г. Матушкин Ю.Г. Генные сети // Вавиловский журн. генетики и селекции. 2013. Т. 17. С. 833−850.

15. Ananko E.A., Podkolodny N.L., Stepanenko I.L., Ignatieva E.V., Podkolodnaya O.A., Kolchanov N.A. GeneNet: a database on structure and functional organisation of gene networks // Nucl. Acids Res. 2002. V. 30. P. 398–401.

16. Schwessinger B. Fundamental wheat stripe rust research in the 21(st) century // New Phytol. 2017. V. 213. P. 1625−1631.

17. Sanseverino W., Hermoso A., D'Alessandro R., Vlasova A., Andolfo G., Frusciante L., Lowy E., Roma G., Ercolano M.R. PRGdb 2.0: towards a community-based database model for the analysis of R-genes in plants // Nucleic Acids Research. 2013. V. 41 (Database issue). P. D1167−1171.

18. Feuillet C., Travella S., Stein N., Albar L., Nublat A., Keller B. Map-based isolation of the leaf rust disease resistance gene Lr10 from the hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 15253−15258.

19. Loutre C., Wicker T., Travella S., Galli P., Scofield S., Fahima T., Feuillet C., Keller B. Two different CC-NBS-LRR genes are required for Lr10-mediated leaf rust resistance in tetraploid and hexaploid wheat // Plant J. 2009. V. 60. P. 1043−1054.

20. Cloutier S., McCallum B.D., Loutre C., Banks T.W., Wicker T., Feuillet C., Keller B., Jordan M.C. Leaf rust resistance gene Lr1, isolated from bread wheat (Triticum aestivum L.) is a member of the large psr567 gene family // Plant Mol. Biol. 2007. V. 65. P. 93−106.

21. Kumar S., Wang Z., Banks T.W., Jordan M.C., McCallum B.D., Cloutier S. Lr1-mediated leaf rust resistance pathways of transgenic wheat lines revealed by a gene expression study using the Affymetrix GeneChip® Wheat Genome Array // Molecular Breeding. 2014. V. 34. P. 127−141.

22. Zhou H., Li S., Deng Z., Wang X., Chen T., Zhang J., Chen S., Ling H., Zhang A., Wang D., Zhang X. Molecular analysis of three new receptor-like kinase genes from hexaploid wheat and evidence for their participation in the wheat hypersensitive response to stripe rust fungus infection // Plant J. 2007. V. 52. P. 420−434.

23. Chen T., Xiao J., Xu J., Wan W., Qin B., Cao A., Chen W., Xing L., Du C., Gao X., Zhang S., Zhang R., Shen W., Wang H., Wang X. Two members of TaRLK family confer powdery mildew resistance in common wheat // BMC Plant Biol. 2016. V. 16: 27. doi 10.1186/s12870-016-0713-8

24. Niu J.S., Zhang L.N., Wang Y.H., Hong D.F. Cloning, characterization and expression analysis of the receptor-like kinase gene (RLK) in common wheat // Zhi Wu Sheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao. 2006. V. 32. P. 79−86.

25. Feuillet C., Reuzeau C., Kjellbom P., Keller B. Molecular characterization of a new type of receptor-like kinase (wlrk) gene family in wheat // Plant Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 943−953.

26. Jiang Z., Ge S., Xing L., Han D., Kang Z., Zhang G., Wang X., Wang X., Chen P., Cao A. RLP1.1, a novel wheat receptor-like protein gene, is involved in the defence response against Puccinia striiformis f. sp. tritici // J. Exp. Bot. 2013. V. 64. P. 3735−3746.

27. Wang G.F., Wei X., Fan R., Zhou H., Wang X., Yu C., Dong L., Dong Z., Wang X., Kang Z., Ling H., Shen Q.H., Wang D., Zhang X. Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90 (Hsp90): functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance // New Phytol. 2011. V. 191. P. 418−431.

28. Wang G.F., Fan R., Wang X., Wang D., Zhang X. TaRAR1 and TaSGT1 associate with TaHsp90 to function in bread wheat (Triticum aestivum L.) seedling growth and stripe rust resistance // Plant Mol. Biol. 2015. V. 87. P. 577−589.

39. Huang L., Brooks S.A., Li W., Fellers J.P., Trick H.N., Gill B.S. Map-based cloning of leaf rust resistance gene Lr21 from the large and polyploid genome of bread wheat // Genetics. 2003. V. 164. P. 655−664.

30. Scofield S.R., Huang L., Brandt A.S., Gill B.S. Development of a virus-induced gene-silencing system for hexaploid wheat and its use in functional analysis of the Lr21-mediated leaf rust resistance pathway // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 2165−2173.

31. Ahmed A.A., Pedersen C., Schultz-Larsen T., Kwaaitaal M., Jørgensen H.J., Thordal-Christensen H. The barley powdery mildew candidate secreted effector protein CSEP0105 inhibits the chaperone activity of a small heat shock protein // Plant Physiol. 2015. V. 168. P. 321−333.

32. Rosewarne G.M., Singh R.P., Huerta-Espino J., William H.M., Bouchet S., Cloutier S., McFadden H., Lagudah E.S. Leaf tip necrosis, molecular markers and β1-proteasome subunits associated with the slow rusting resistance genes Lr46/Yr29 // Theor Appl Genet. 2006. V. 112. P. 500−508.

33. Mago R., Tabe L., McIntosh R.A., Pretorius Z., Kota R., Paux E., Wicker T., Breen J., Lagudah E.S., Ellis J.G., Spielmeyer W. A multiple resistance locus on chromosome arm 3BS in wheat confers resistance to stem rust (Sr2), leaf rust (Lr27) and powdery mildew // Theor. Appl. Genet. 2011. V. 123. P. 615−623.

34. Spielmeyer W., Mago R., Wellings C., Ayliffe M. Lr67 and Lr34 rust resistance genes have much in common-they confer broad spectrum resistance to multiple pathogens in wheat // BMC Plant Biol. 2013. V. 13: 96. doi 10.1186/1471-2229-13-96

35. Herrera-Foessel S.A., Singh R.P., Lillemo M., Huerta-Espino J., Bhavani S., Singh S., Lan C., Calvo-Salazar V., Lagudah E.S. Lr67/Yr46 confers adult plant resistance to stem rust and powdery mildew in wheat // Theor. Appl. Genet. 2014. V. 127. P. 781−789.

36. Krattinger S.G., Lagudah E.S., Spielmeyer W., Singh R.P., Huerta-Espino J., McFadden H., Bossolini E., Selter L.L., Keller B. A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat // Science. 2009. V. 323. P.1360−1363.

37. Muhovski Y., Jacquemin J.M., Batoko H. Identification and differential induction of ABCG transporter genes in wheat cultivars challenged by a deoxynivalenol-producing Fusarium graminearum strain // Mol. Biol. Rep. 2014. V. 41. P. 6181−6194.

38. Bolton M.D., Kolmer J.A., Xu W.W., Garvin D.F. Lr34-mediated leaf rust resistance in wheat: transcript profiling reveals a high energetic demand supported by transient recruitment of multiple metabolic pathways // Mol. Plant Microbe Interact. 2008. V. 21. P. 1515−1527.

49. Ruan Y.L. Sucrose metabolism: gateway to diverse carbon use and sugar signaling // Annu. Rev. Plant Biol. 2014. V. 65. P. 33−67.

40. Moore J.W., Herrera-Foessel S., Lan C., Schnippenkoetter W., Ayliffe M., Huerta-Espino J., Lillemo M., Viccars L., Milne R., Periyannan S., Kong X., Spielmeyer W., Talbot M., Bariana H., Patrick J.W., Dodds P., Singh R., Lagudah E. A recently evolved hexose transporter variant confers resistance to multiple pathogens in wheat // Nat. Genet. 2015. V. 47. P. 1494−1498.

41. Chen L.Q., Hou B.H., Lalonde S., Takanaga H., Hartung M.L., Qu X.Q., Guo W.J., Kim J.G., Underwood W., Chaudhuri B., Chermak D., Antony G., White F.F., Somerville S.C., Mudgett M.B., Frommer W.B. Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens // Nature. 2010. V. 468. P. 527−532.

42. Chong J., Piron M.C., Meyer S., Merdinoglu D., Bertsch C., Mestre P. The SWEET family of sugar transporters in grapevine: VvSWEET4 is involved in the interaction with Botrytis cinerea // J. Exp. Bot. 2014. V. 65. P. 6589−6601.

43. Chandran D. Co-option of developmentally regulated plant SWEET transporters for pathogen nutrition and abiotic stress tolerance // IUBMB Life. 2015. V. 67. P. 461−471.

44. Liu J., Han L., Huai B., Zheng P., Chang Q., Guan T., Li D., Huang L., Kang Z. Down-regulation of a wheat alkaline/neutral invertase correlates with reduced host susceptibility to wheat stripe rust caused by Puccinia striiformis // J. Exp. Bot. 2015. V. 66. P. 7325−7338.

45. Yang Y., Zhao J., Liu P., Xing H., Li C., Wei G., Kang Z. Glycerol-3-phosphate metabolism in wheat contributes to systemic acquired resistance against Puccinia striiformis f. sp. tritici // PLoS One. 2013. V. 8: e81756. doi 10.1371/journal.pone.0081756

46. Kumar D. Salicylic acid signaling in disease resistance // Plant Sci. 2014. V. 228. P. 127−134.

47. Яруллина Л.Г., Ахатова А.Р., Касимова Р.И. Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы в регуляции взаимоотношений растений с патогенами // Физиология растений. 2016. Т. 63. С. 205−217.

48. Feng H., Wang X., Sun Y., Wang X., Chen X., Guo J., Duan Y., Huan L., Kang Z. Cloning and characterization of a calcium binding EF-hand protein gene TaCab1 from wheat and its expression in response to Puccinia striiformis f. sp. tritici and abiotic stresses // Mol. Biol. Rep. 2011. V. 38. P. 3857−3866.

49. Al-Attala M.N., Wang X., Abou-Attia M.A., Duan X., Kang Z. A novel TaMYB4 transcription factor involved in the defence response against Puccinia striiformis f. sp. tritici and abiotic stresses // Plant Mol. Biol. 2014. V. 84. P. 589−603.

50. Fu Y., Duan X., Tang C., Li X., Voegele R.T., Wang X., Wei G., Kang Z. TaADF7, an actin-depolymerizing factor, contributes to wheat resistance against Puccinia striiformis f. sp. tritici // Plant J. 2014. V. 78. P. 16−30.

51. Wang Y., Loake G.J., Chu C. Cross-talk of nitric oxide and reactive oxygen species in plant programed cell death // Front Plant Sci. 2013. V. 4: 314. doi 10.3389/fpls.2013.00314

52. Abou-Attia M.A., Wang X., Nashaat Al-Attala M., Xu Q., Zhan G., Kang Z. TaMDAR6 acts as a negative regulator of plant cell death and participates indirectly in stomatal regulation during the wheat stripe rust-fungus interaction // Physiol. Plant. 2016. V. 156. P. 262−277.

53. Lu S., Faris J.D., Sherwood R., Friesen T.L., Edwards M.C. A dimeric PR-1-type pathogenesis-related protein interacts with ToxA and potentially mediates ToxA-induced necrosis in sensitive wheat // Mol. Plant Pathol. 2014. V. 15. P. 650−663.

54. Zhang W.J., Pedersen C., Kwaaitaal M., Gregersen P.L., Mørch S.M., Hanisch S., Kristensen A., Fuglsang A.T., Collinge D.B., Thordal-Christensen H. Interaction of barley powdery mildew effector candidate CSEP0055 with the defence protein PR17c // Mol. Plant Pathol. 2012. V. 13. P. 1110−1119.

55. Смирнова О.Г., Кочетов А.В. Клеточная стенка растений и механизмы устойчивости к патогенам // Вавиловский журн. генетики и селекции. 2015. Т. 19. С. 715−723.

56. Zhang G., Li Y.M., Zhang Y., Dong Y.L., Wang X.J., Wei G.R., Huang L.L., Kang Z.S. Cloning and characterization of a pathogenesis-related protein gene TaPR10 from wheat induced by stripe rust pathogen // Agricultural Sciences in China. 2010. V. 9. P. 549–556.

57. Wang X., Tang C., Deng L., Cai G., Liu X., Liu B., Han Q., Buchenauer H., Wei G., Han D., Huang L., Kang Z. Characterization of a pathogenesis-related thaumatin-like protein gene TaPR5 from wheat induced by stripe rust fungus // Physiol. Plant. 2010. V. 139. P. 27−38.

58. Xia N., Zhang G., Liu X.Y., Deng L., Cai G.L., Zhang Y., Wang X.J., Zhao J., Huang L.L., Kang Z.S. Characterization of a novel wheat NAC transcription factor gene involved in defense response against stripe rust pathogen infection and abiotic stresses // Mol. Biol. Rep. 2010. V. 37. P. 3703−3712.

59. Feng H., Duan X., Zhang Q., Li X., Wang B., Huang L., Wang X., Kang Z. The target gene of tae-miR164, a novel NAC transcription factor from the NAM subfamily, negatively regulates resistance of wheat to stripe rust // Mol. Plant Pathol. 2014. V. 15. P. 284−296.

60. Liu J., Zhang T., Jia J., Sun J. The wheat mediator subunit TaMED25 interacts with the transcription factor TaEIL1 to negatively regulate disease resistance against powdery mildew // Plant Physiol. 2016. V. 170. P. 1799−1816.

61. Wang X., Tang C., Zhang H., Xu J.R., Liu B., Lv J., Han D., Huang L., Kang Z. TaDAD2, a negative regulator of programmed cell death, is important for the interaction between wheat and the stripe rust fungus // Mol. Plant Microbe Interact. 2011. V. 24. P. 79−90.

62. Liu P., Myo T., Ma W., Lan D., Qi T., Guo J., Song P., Guo J., Kang Z. TaTypA, a ribosome-binding GTPase protein, positively regulates wheat resistance to the stripe rust fungus // Front. Plant Sci. 2016. V. 7: 873. doi 10.3389/fpls.2016.00873

63. Feng H., Liu W., Zhang Q., Wang X., Wang X., Duan X., Li F., Huang L., Kang Z. TaMDHAR4, a monodehydroascorbate reductase gene participates in the interactions between wheat and Puccinia striiformis f. sp. tritici // Plant Physiol. Biochem. 2014. V. 76. P. 7−16.

64. Feng H., Wang X., Zhang Q., Fu Y., Feng C., Wang B., Huang L., Kang Z. Monodehydroascorbate reductase gene, regulated by the wheat PN-2013 miRNA, contributes to adult wheat plant resistance to stripe rust through ROS metabolism // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1839. P. 1−12.

65. Wang X., Wang X., Feng H., Tang C., Bai P., Wei G., Huang L., Kang Z. TaMCA4, a novel wheat metacaspase gene functions in programmed cell death induced by the fungal pathogen Puccinia striiformis f. sp. tritici // Mol. Plant Microbe Interact. 2012. V. 25. P. 755−764.

66. Hao Y., Wang X., Wang K., Li H., Duan X., Tang C., Kang Z. TaMCA1, a regulator of cell death, is important for the interaction between wheat and Puccinia striiformis // Sci. Rep. 2016. V. 6: 26946. doi 10.1038/srep26946

67. Coll N.S., Vercammen D., Smidler A., Clover C., Van Breusegem F., Dangl J.L., Epple P. Arabidopsis type I metacaspases control cell death // Science. 2010. V. 330. P. 1393−1397.

68. Guo J., Bai P., Yang Q., Liu F., Wang X., Huang L., Kang Z. Wheat zinc finger protein TaLSD1, a negative regulator of programmed cell death, is involved in wheat resistance against stripe rust fungus // Plant Physiol. Biochem. 2013. V. 71. P. 164−172.

69. Fu D., Uauy C., Distelfeld A., Blechl A., Epstein L., Chen X., Sela H., Fahima T., Dubcovsky J. A kinase-START gene confers temperature-dependent resistance to wheat stripe rust // Science. 2009. V. 323. P. 1357−1360.

70. Gou J.Y., Li K., Wu K., Wang X., Lin H., Cantu D., Uauy C., Dobon-Alonso A., Midorikawa T., Inoue K., Sánchez J., Fu D., Blechl A., Wallington E., Fahima T., Meeta M., Epstein L., Dubcovsky J. Wheat stripe rust resistance protein WKS1 reduces the ability of the thylakoid-associated ascorbate peroxidase to detoxify reactive oxygen species // Plant Cell. 2015. V. 27. P. 1755−1770.

71. Tang C., Deng L., Chang D., Chen S., Wang X., Kang Z. TaADF3, an actin-depolymerizing factor, negatively modulates wheat resistance against Puccinia striiformis // Front. Plant Sci. 2016. V. 6: 1214. doi 10.3389/fpls.2015.01214

72. Zhang H., Hu W., Hao J., Lv S., Wang C., Tong W., Wang Y., Wang Y., Liu X., Ji W. Genome-wide identification and functional prediction of novel and fungi-responsive lincRNAs in Triticum aestivum // BMC Genomics. 2016. V. 17: 238. doi 10.1186/s12864-016-2570-0

73. Смирнова О.Г., Кочетов А.В. База данных генов, повышающих устойчивость пшеницы и родственных ей злаков к патогенным грибам // Вавиловский журн. генетики и селекции. 2016. Т. 20. С. 904−908.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. (а) Генная сеть формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами. Обозначения: - гены, - белки, - низкомолекулярные соединения. Стрелки серого цвета с открытым концом обозначают позитивное действие, стрелки черного цвета с замкнутым концом обозначают негативное действие.

(б) Схема генной сети формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами. Стрелки с острым концом обозначают позитивный эффект, стрелки с тупым концом негативный эффект.

Рис. 2. Участие нуклеотид-связывающих белков-рецепторов в защитном ответе. Стрелки обозначают позитивное действие.

Белок LR1 оказывает положительно действие на уровень транскрипционных факторов WRKY40 и WRKY70. На экспрессию гена Lr1 влияет белок LR28. Мультимерный комплекс, в состав которого входят RAR1, GST1, HSP90, поддерживает структуру белка LR21, который положительно влияет на реакцию сверхчувствительности. Действие патогена повышает уровень салициловой кислоты и активных форм кислорода. Действие этих регуляторов приводит к повышению уровня рецептор-подобных киназ RLK и рецептор-подобных белков RLPR1.1, которые, в свою очередь, повышают уровень защитных PR белков и реакцию сверхчувствительности. Белки LR10 и RGA2 функционируют вместе, повышая защитный ответ.

Рис. 3. Регуляция уровня АФК. Стрелки с острым концом обозначают позитивный эффект, стрелки с тупым концом – негативный эффект.

При инфекции изменяется содержание ряда белков, которые влияют на уровень АФК и защитный ответ. Белки MCA4, DAD2, WKS1, ADF7 положительно влияют на содержание АФК, их экспрессия положительно регулируется патогеном. Снижение во время инфекции негативного действия MDHAR способствует повышению уровня АФК. ADF3 функционирует как негативный регулятор устойчивости пшеницы к Pst и его экспрессия негативно регулируется авирулентной расой патогена. В тоже время, белок оказывает положительное влияние на уровень АФК. Рост экспрессии негативных регуляторов MDAR6 и MCA1 ограничивает повышение уровня АФК. Взаимодействие между АФК и TYPA по принципу положительной обратной связи повышает количество АФК и защитный ответ.

Рис. 4. Домашняя страница PRG_GENE.

Рис. 5. Поисковая таблица для PRG_GENE.

Рис. 6. Результаты поиска. Найдено семь генов, удовлетворяющих запросу.