УДК 581.1

НОВЫЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОДНОГО ПОТЕНЦИАЛА АПОПЛАСТА КЛЕТОК МЕЗОФИЛЛА В ПОДУСТЬИЧНОЙ ПОЛОСТИ ЛИСТА

 

© 2017 г. П. Ю. Воронинa,1, З. Ф. Рахманкуловаa, Е. В. Шуйскаяa, С. Н. Маевскаяa, М. К. Николаеваa, А. П. Максимовb, Т. Х. Максимовb, Н. А. Мясоедовa, Ю. В. Балнокинa, В. П. Рымарьc, В. В. Валдайскихc, Вл. В. Кузнецовa

aФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

bФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, Якутск

cФедеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, Екатеринбург

Поступила в редакцию 30.06.2016 г.

Описан новый метод количественного определения водного потенциала апопласта клеток мезофилла в подустьичной полости листьев травянистых (кукуруза, просо, пшеница, амарант, сведа) и древесных (лиственница, сосна и береза) видов растений с помощью современных приборов для измерения фотосинтетического СО22О газообмена. Метод заключается в инструментальном определении на свету такого уровня влажности над поверхностью листа, по достижении которого транспирация снижается до нуля без заметного подавления фотосинтетической ассимиляции СО2, что позволяет рассчитать значение водного потенциала на границе водной и газовой фаз апопласта клеток мезофилла в подустьичной полости.

----------------------------------

Сокращения: RH – относительная влажность воздуха (от Relative Humidity); VPD – дефицит давления водяных паров (от Vapor Pressure Deficit).

1Адрес для корреспонденции: Воронин Павел Юрьевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: pavel@ippras.ru

Ключевые слова: травянистые и древесные растения – транспирация – фотосинтез – лист– устьица – водный потенциал

ВВЕДЕНИЕ

Большинство высших сосудистых растений осуществляет газообмен с атмосферой с помощью листьев. Подустьичная полость представляет собой внутрилистовое свободное сообщающееся межклеточное пространство, примыкающее к устьицам. Лист, будучи специализированным органом CO2/H2O газообмена, одновременно с фотосинтезом осуществляет транспирацию воды через устьица. Благодаря этому свойству листа проводимость устьиц рассчитывают с помощью транспирации. При расчете градиента упругости водяных паров от подустьичной полости до прилистного слоя над поверхностью листа, концентрацию водяных паров в подустьичной полости по определению принимают насыщающей. В 70-е годы прошлого века вопрос о степени насыщения паров воды в подустьичной полости был предметом активной дискуссии. В конечном итоге гипотеза “начинающего подсыхания” устьиц была отвергнута [1, с. 22]. К настоящему времени положение о полном насыщении водяных паров в подустьичной полости окончательно закреплено в теории фотосинтетического газообмена [2, 3].

Подтвердить или опровергнуть изложенную точку зрения не представляется возможным, используя для этого традиционный и наиболее распространенный в настоящее время метод определения водного потенциала ткани листа с помощью камеры давления [4, 5]. Данный метод не позволяет вычленить значение водного потенциала на испаряющей воду поверхности клеток мезофилла из среднего значения водного потенциала листа. Другим очевидным ограничением этого метода является невозможность определения с его помощью водного потенциала интактного листа. Вместе с тем доступные в настоящее время серийные измерительные системы для определения фотосинтетического СО22О газообмена или их аналоги, собранные из серийных приборов [6], позволяют решить эту задачу.

Современная высокочувствительная серийная аппаратура для расчета проводимости устьиц при компьютерной обработке физических показателей газообмена листа in vivo базируется в качестве аксиомы на предположении о полном насыщении подустьичной полости парами воды [7]. Между тем достигнутый прогресс в разработке инструментальных средств кондиционирования микроклимата вокруг листа в ходе измерения его фотосинтетического газообмена позволяет экспериментально проверить достоверность предположения о 100% насыщении подустьичной полости парами воды.

Ранее нами на ряде взрослых древесных растений в природных условиях с помощью современных портативных газометрических систем LI-6400 (LI-COR, США) и GFS-3000 (Walz, Германия) были выполнены измерения фотосинтетического СО22О газообмена неотделенных листьев и хвои. В результате было показано наличие небольшого, но заметного дефицита упругости водных паров в подустьичной полости [8]. В настоящей работе на основе измерений СО22О газообмена листа впервые описан метод инструментального определения in situ величины относительной влажности в подустьичной полости фотосинтезирующего листа, что позволяет рассчитать водный потенциал на поверхности апопласта клеток мезофилла у многих видов растений.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В различных экспериментальных моделях использовали растения разных видов, выращенных в условиях фитотрона и вегетационного домика, или произрастающих в природных насаждениях.

1) В лабораторных условиях растения выращивали из семян, во всех случаях для измерений брали третий настоящий лист. Семена в течение 30 мин дезинфицировали в 15% растворе перекиси водорода, а затем промывали дистиллированной водой. Семена проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в термостате при температуре 25оС в течение 3 суток.

Проростки проса (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) и пшеницы (Triticum aestivum L.) в возрасте 3 – 4 дней пересаживали на перлит с питательным раствором Хогланда. Растения выращивали в фитотроне Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (ИФР РАН) при освещении люминесцентными лампами (200 мкмоль/(с м2) ФАР), 16-часовом фотопериоде и температуре 25/20оС (день/ночь). Растения кукурузы (Zea mays L.) сорта “Тройная сладость” выращивали в фитотроне ИФР РАН до трехнедельного возраста в 6 литровых сосудах (по 5 растений на сосуд) на смеси песка и гумусированной почвы (соотношение 2:1), поддерживая влажность почвы на уровне 60% от полной влагоемкости при освещении люминесцентными лампами (100 мкмоль/(с м2) ФАР), 12-часовом фотопериоде и температуре 32/25оС (день/ночь).

Семена сведы (Suaeda altissima (L.) Pall.) были собраны с растений, произраставших на берегу соленого озера Эльтон в Волгоградской области. Семена проращивали во влажном песке при комнатной температуре; через три недели проростки пересаживали в 3-х литровые стеклянные сосуды (4 растения на сосуд) на аэрируемый питательный раствор Robinson and Downton, в который ежедневно добавляли по 100 мМ NaCl до конечной концентрации 750 мМ. Дальнейший рост S. altissima происходил в факторостатной камере при 24оС в условиях водной культуры. Питательный раствор меняли каждые две недели. Растения освещали натриевыми лампами высокого давления DHа 3/Reflux 400 Вт (Россия) 16 часов в сутки при интенсивности света 150 Вт/м2. В экспериментах использовали взрослые листья 60-дневных растений.

2) На территории Ботанического сада Уральского федерального университета (г. Екатеринбург, Средний Урал) растения амаранта (Amaranthus cruentis L.) выращивали в вегетационном домике при естественных условиях освещения и температуре окружающей среды. Растения выращивали из рассады до стадии выметывания метелки в 10 л пластиковых сосудах по одному растению на смеси гумусированной почвы и песка (соотношение 1:1), поддерживая влажность почвы на уровне 60% от полной влагоемкости в течение 90 дней с момента высадки рассады.

3) В полевых наблюдениях июляавгуста 2010 2012 гг. на стационаре Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск) и Ботанического сада Уральского федерального университета (г. Екатеринбург) днем с 10:00 до 16:00 исследовали фотосинтетический СО22О газообмен хвои второго и третьего года и взрослых листьев 40 50 летних деревьев Pinus sylvestris L., Larix cajanderi L. (Якутск) и Betula platyphilla L. (Якутск), а также Larix sibirica Ledeb. (Екатеринбург) и Betula pendula Roth. (Екатеринбург).

Климатические условия на биологической станции “Спасская Падь” Института биологических проблем криолитозоны СО РАН вблизи г. Якутска (62°15′ c.ш., 129°37′ в.д.) в годы наблюдений были типичными для региона Центральной Якутии: средняя температура воздуха за вегетационный период (майсентябрь) составляла около 14оС, сумма осадков  163 мм. Минимальная температура воздуха в зимний период не опускалась ниже -48оС. Высота снежного покрова в декабреянваре составляла 44  48 см. Начало заморозков третья декада сентября, устойчивый переход ночной температуры через 0оС  начало октября. Преобладающая зональная растительность  лиственничники с примесью сосны и березы [9, 10]. Ботанический сад Уральского федерального университета (г. Екатеринбург) (56о36' с.ш., 61o3' в.д.), расположен в зоне неустойчивого увлажнения на границе восточных предгорий Среднего Урала и Зауральской складчатой возвышенности. Зональная растительность  предлесостепные сосново-березовые леса из P. sylvestris, B. pendula и Populus tremula L. Климат умеренно-континентальный, среднегодовая температура +1.5  +0.1oС, сумма положительных среднесуточных температур за май  сентябрь от 2000 до 3200oС, самый теплый месяц июль (+17oС), самый холодный  январь (16oС). Среднегодовое количество осадков 350 400 мм. Средняя многолетняя (за 80 лет) сумма осадков за вегетационный период составляет примерно 230 мм [11, 12].

Определение стационарного СО22О-газообмена осуществляли с помощью различных измерительных устройств.

1) В лабораторных опытах стационарный СО2-газообмен листьев измеряли с помощью одноканального ИК-газоанализатора LI-820 (LI-COR, США) в открытой системе при атмосферной концентрации СО2 и интенсивности света 200 мкмоль/(с м2) области ФАР в составе описанной ранее установки [6]. Для этого лист помещали в листовую камеру-прищепку при комнатной температуре и освещали оптоволоконным световодом от осветителя KL 1500 LCD (Shott, Германия) с галогеновой лампой (150 Вт, Philips, Нидерланды). Транспирацию листа рассчитывали на основании разности влажности газа на входе и выходе из листовой камеры. В опорном газовом потоке на входе в листовую камеру поддерживали известную постоянную относительную влажность 30% при 25оС с помощью увлажнителя LI-610 (LI-COR, США). Для определения влажности на выходе из листовой камеры использовали психрометрический датчик HMP50 (Vaisala INTERCAP, Финляндия). Питающим газом служил атмосферный воздух, предварительно собранный в 60 литровом полиэтиленовом газгольдере. Расход газа в 100 мл/мин обеспечивал непрерывную работу установки в течение 8 часов. Смесительный узел газового тракта позволял стабильно поддерживать концентрацию СО2 в 380 ppm в воздушном потоке на входе в листовую камеру.

2) В вегетационном опыте с растениями амаранта измерения фотосинтетического СО22О газообмена полностью сформированных листьев четвертого яруса проводили встроенным LED осветителем (Walz, Германия) при освещенности 1800 мкмоль/(с м2) ФАР в термостатируемой (20оС) листовой камере-прищепке портативной системы для измерения фотосинтеза GFS-3000 (Walz, Германия).

3) В природных условиях фотосинтетический СО22О газообмен хвои лиственницы, сосны и листьев березы измеряли в Ботаническом саду Уральского федерального университета с помощью портативной системы для измерения фотосинтеза GFS-3000 (Walz, Германия) и в Якутии  LI-6400 (LI-COR, США) [8].

Определение относительной влажности в подустьичной полости. Метод заключается в инструментальном определении такого уровня влажности над поверхностью листа, при достижении которого транспирация листа снижается до нуля. Это значение влажности равно влажности в подустьичной полости. В физиологическом диапазоне температур на свету при открытых устьицах ранее была экспериментально показана строгая линейная зависимость дефицита водяных паров над листом (VPD) от относительной влажности воздуха над поверхностью листа [8]. Это соответствует современным теоретическим представлениям о линейной зависимости транспирации листа от градиента давления водяных паров между подустьичной полостью листа и окружающей лист атмосферой. Поэтому, измеряя скорость транспирации на свету при некоторой постоянной температуре и разных значениях относительной влажности атмосферы над поверхностью листа, с помощью линейной аппроксимации можно получить равновесное с подустьичным значение относительной влажности, при котором фотосинтетическая ассимиляция СО2 остается практически неизменной (рис. 1а), а транспирация полностью прекращается (рис. 1б). В этом случае постоянство фотосинтетического СО2 газообмена листа служит контролем открытости устьиц.

Определение водного потенциала на границе водной и газовой фаз апопласта на поверхности клеток мезофилла, выстилающих подустьичную полость. Согласно теории [1, с. 15; 13] над поверхностью водного раствора зависимость равновесного давления водяного пара от водного химического потенциала описывается формулой:

е = eo × exp(ψ × V/(R × T)),

где e  равновесное давление паров воды над водным раствором, eo  давление насыщенного водяного пара над поверхностью чистой воды (ψ = 0) при абсолютной температуре T, R  универсальная газовая постоянная 8.31441 Дж/(моль oK), T  абсолютная температура (оK), V  молярный объем воды (18×10-6 м3/моль). Поэтому,

ψ = R × T/V ln(e/eo). (1)

Физическая размерность водного потенциала видна из формулы (1) и выражается в Дж/(моль м3) или Па/моль.

По определению, относительная влажность представлена формулой:

RH = (e/eo) × 100%, (2)

где eo  давление насыщенного водяного пара (Па), е  актуальное давление водяного пара (Па) при температуре t (oC).

Значение влажности воздуха, при которой транспирация прекращается, получали линейной аппроксимацией экспериментально полученной зависимости транспирации от относительной влажности воздуха.

Применение формул (1) и (2) позволяет рассчитать значение водного потенциала, исходя из экспериментально определенных значений относительной влажности (RH) в подустьичной полости при данной температуре листа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отсутствие тесной корреляции между открытостью устьиц и интенсивностью транспирации косвенно свидетельствует в пользу существования некоторого градиента водного потенциала от внутренних областей апопласта клеточной стенки к его пограничной с газовой фазой части (цит. по [1, с. 17]). Прямые экспериментальные измерения диффузионной проводимости устьиц позволяли предположить наличие незначительного дефицита насыщения давления водяного пара в подустьичной полости [1, с. 23].

В условиях постоянно открытых устьиц на свету по определению транспирационный поток пропорционален разности парциального давления паров воды в подустьичной полости и над поверхностью листа (рис. 2). Следуя общепринятому предположению [14], мы считаем, что в подустъичной полости концентрация водяных паров находится в равновесии с водной фазой апопласта клеток мезофилла. Обозначенный стрелкой транспирационный поток из листа в атмосферу возможен лишь в случае наличия градиента парциального давления водяного пара между подустьичной полостью и атмосферой (рис. 2а). Таким образом, по мере снижения этого градиента давления транспирация будет снижаться до нуля в случае выравнивания внешнего парциального давления водяных паров над поверхностью листа и в подустьичной полости (рис. 2б). Это экспериментально достигнутое парциальное давление в точке прекращения транспирации будет равно парциальному давлению водяных паров в подустьичной полости. Используя данную величину, можно рассчитать водный потенциал водной фазы апопласта на поверхности клеток мезофилла, обращенной в подустьичную полость (см. раздел МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ).

Водная фаза апопласта на поверхности клеток мезофилла листа является конечной точкой непрерывности водного тока по апопласту клеток мезофилла листа перед выходом воды в газовую фазу атмосферы. Именно это обстоятельство определяет важное физиологическое значение водного потенциала листа в этой точке. Очевидно, что водный потенциал корнеобитаемого слоя почвы и данный показатель совместно характеризуют водный статус растения в целом. В разных экспериментальных моделях измерения водного потенциала с помощью описываемого в данной статье метода на границе водной и газовой фаз апопласта клеток мезофилла в подустьичной полости листьев растений разных жизненных форм и экологических групп, представленных в таблице, лежат в диапазоне отрицательных значений от нескольких единиц до нескольких десятков МПа. Известно, что капиллярность придает почвенному раствору водный потенциал от 0.03 до 2 МПа, но большая часть почвенного раствора имеет ψ почвы > 0.1 МПа. В засоленных почвах большое значение имеет осмотический компонент (ψ почвы), который может снижать водный потенциал почвы до 0.2 МПа [5, c. 109]. Из данных таблицы 1 следует, что на границе газовой и водной фазы апопласта клеток мезофилла в подустьичной полости значения водного потенциала существенно ниже обычных значений водного потенциала почвы. Это позволяет снять энергетическое ограничение на движение воды по ксилеме и апопласту от почвы до устьиц фотосинтезирующего листа [15, с. 133]. Отрицательный водный потенциал на границе водной и газовой фаз апопласта на поверхности клеток мезофилла листа у разных видов травянистых и древесных растений свидетельствует в пользу общего для них замыкания водного потока от корневой системы до пунктов массовой загрузки фотосинтатов во флоэму, которое дополняет осмотический механизм водного транспорта во флоэме [16, с. 183]

 

Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 16-14-10224 за исключением полевых исследований 2010 – 2012 гг., которые были частично финансированы Базовым проектом Cибирского отделения Российской академии наук VI.56.1.6. “Продукционный процесс и физиолого-биохимические механизмы устойчивости растений в криолитозоне”.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Лайск А.Х. Кинетика фотосинтеза и фотодыхания С3-растений. М.: Наука. 1977. 194 с.
  2. Farquhar G.D., von Caemmerer S., Berry J.A. A Biochemical Model of Photosynthetic CO2 Assimilation in Leaves of C3 Species // Planta. 1980. V. 149. P. 7890.
  3. von Caemmerer, Farquhar G., Berry J. Biochemical Model of C3 Photosynthesis // Photosynthesis in silico: Understanding Complexity from Molecules to Ecosystems (A. Laisk, L. Nedbal and Govindjee Eds) Dordrecht: Springer. 2009. P. 209230.
  4. Рахи М. Аппаратура для исследования компонентов водного потенциала листьев // Физиология растений. 1973. T. 20. С. 215221.
  5. Биддл К.Л., Людлоу М.М., Хонисетт Дж.Л. Водный режим // Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения / Пер. с англ. Н.Л. Гудскова, Н. В. Обручевой, К. С. Спекторова и С. С. Чаяновой; под ред. и с предисл. А. Т. Мокроносова. М.: ВО “Агропромиздат”. 1989. 460 с.
  6. Воронин П.Ю. Установка для измерений флуоресценции хлорофилла, СО2-газообмена и транспирации отделенного листа // Физиология растений. 2014. Т. 61. С. 291296.
  7. Portable Gas Exchange Fluorescence System GFS-3000. Handbook of Operation. Effeltrich: Heinz Walz GmbH. 2007. 197 p.
  8. Voronin P., Maksimov A., Maximov T., Fedoseeva G. Stomatal cavity water vapor deficit in intact leaves of some Siberian trees // Proceedings of 2nd International Conference "Global Warming and the Human-Nature Dimension in Siberia: Social Adaptation to the Changes of the Terrestrial Ecosystem, with an Emphasis on Water Environments" and the 7th Annual International Workshop "C/H2O/Energy balance and climate over boreal and arctic regions with special emphasis on eastern Eurasia" (Ed. by T. Maksimov et al.) Yakutsk: Institute for Biological Problems of Cryolithozone. 2013. P. 2426.
  9. Гаврилова М.К. Климат Центральной Якутии. Изд. 2-е, перераб. и доп. Якутск: Якутское книжн. изд-во. 1973. 119 с.
  10. Научно-прикладной справочник по климату СССР. Сер. 3. Многолетние данные. Вып. 24. Якутская АССР. Л.: Гидрометеоиздат. 1989. 607 с.
  11. Агроклиматические ресурсы Свердловской области. Л.: Гидрометиздат, 1978. 210 с.
  12. Атлас Свердловской области. Екатеринбург: Роскартография. 1997. 48 с.
  13. Milthorpe F.L. Plant factors involved in transpiration // Plant water relationships in arid and semi-arid conditions. 1961. V. 16. Paris: UNESCO. P. 107117.
  14. Taiz L., Zeiger E. Plant Physiology Online: Leaf Transpiration and Water Vapor Gradients. http://6e.plantphys.net/topic04.04.html
  15. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука. 1976. 646 с.
  16. Роньжина Е.С. Концепция донорно-акцепторных отношений А.Т. Мокроносова: выводы, итоги, перспективы // Фотосинтез: физиология, онтогенез, экология. (Ред. Е.С. Роньжина). Калининград: Изд-во ФГОУ ВПО “КГТУ”. 2009. С. 179205.

Значения водного потенциала ψ в подустьичной полости листа у некоторых травянистых и древесных видов растений

 

Вид

Температура листа

Относительная влажность в устьицах (RH)

ψ, MПа

n*

Экспериментальная модель

Измерительная система

Условия опыта

Кукуруза

27.5 ± 0.4

79.8 ± 0.3

-31.3 ± 3.2

4

отделенный лист

[6]

фитотрон

Кукуруза

25.2 ±0.1

82.5 ± 0.3

-26.5 ± 0.5

12

неотделенный лист

[6]

фитотрон

Пшеница

23.5 ± 0.4

91.0 ± 4.0

-14.0 ± 6.0

6

отделенный лист

[6]

фитотрон

Просо

22.5 ± 0.2

87.0 ± 3.0

-19.0 ± 4.0

6

отделенный лист

[6]

фитотрон

Сведа

22.0 ±0.2

83.9 ± 1.8

-24.3 ± 2.9

11

неотделенный лист

[6]

фитотрон

Амарант

31.2 ± 0.1

91.7 ± 1.1

-12.2 ± 0.5

5

неотделенный лист

GFS-3000

вегетационный домик

Лиственница

25.0 ± 0.1

97.2 ± 0.2

-3.9±0.1

3

неотделенный лист

LI-6400

полевые, Якутск

Лиственница

25.0 ± 0.1

96.7 ± 0.2

-4.6 ± 0.1

3

неотделенный лист

GFS-3000

полевые, Екатеринбург

Береза

25.0 ± 0.1

97.0 ± 0.2

-4.2 ± 0.1

3

неотделенный лист

LI-6400

полевые, Якутск

Береза

25.0 ± 0.1

90.1 ± 0.2

-14.3 ± 0.1

3

неотделенный лист

GFS-3000

полевые, Екатеринбург

Сосна

25.0 ± 0.1

97.0 ± 0.2

-4.2 ± 0.1

3

неотделенный лист

LI-6400

полевые, Якутск

Сосна

25.0 ± 0.1

98.0 ± 0.2

-7.0 ± 0.1

3

неотделенный лист

GFS-3000

полевые, Екатеринбург

Примечание. *  Представлено число биологических повторностей, использованных для расчета средних значений и их стандартных ошибок.

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Фотосинтетический СО22О газообмен листьев кукурузы при разных значениях относительной влажности воздуха в листовой камере. Представлены результаты определения фотосинтеза (а) и транспирации (б) неотделенных листьев 3-х недельных проростков в двух (1 и 2) независимых сериях лабораторных опытов. Каждая точка на графике представляет среднее значение из 6 биологических повторностей, бары представляют стандартную ошибку среднего.

 

Рис. 2. Градиент парциального давления водных паров между подустьичной полостью и прилистным слоем воздуха. Парциальное давление паров воды над поверхностью листа меньше (а) или равно (б) парциальному давлению паров воды в подустьичной полости. Транспирационный поток (обозначен стрелкой) из листа в атмосферу возможен лишь в случае градиента парциального давления водяного пара между подустьичной полостью и атмосферой.